細(xì)胞轉(zhuǎn)染的種類主要是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，目的和區(qū)別如下所示：

隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。如下圖所示：

下面分別介紹下原理和應(yīng)用特點(diǎn)：

原理：帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。

主要應(yīng)用：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

特點(diǎn)：相對簡便、重復(fù)比磷酸鈣好，但對細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時(shí)需除去血清。聚合物濃度、核酸或蛋白質(zhì)與聚合物的比值，以及轉(zhuǎn)染的持續(xù)時(shí)間是重要的優(yōu)化參數(shù)，另外，此方法對附著細(xì)胞的轉(zhuǎn)染非常有效，也可用于某些懸浮細(xì)胞系。（詳細(xì)信息可參考文獻(xiàn)：Gulick T .Transfection using DEAE-dextran. Curr Protoc Cell Biol. 2003 Aug;Chapter 20:Unit 20.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2004s19.）。

原理：DNA與濃縮的氯化鈣溶液混合，然后添加到含有磷酸鹽離子的緩沖液中，形成磷酸鈣-DNA沉淀物，磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞。

主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，染瞬轉(zhuǎn)染

特點(diǎn)：不適用于原代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高），操作簡便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用細(xì)胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染時(shí)拷貝數(shù)較多。

原理：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進(jìn)入細(xì)胞。(若DNA濃度過高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力)。

主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞

特點(diǎn)：使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應(yīng)用。（生工產(chǎn)品編號(hào)E607403 LipoHigh 脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑）。結(jié)果如下圖所示：

pEGFP-N1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天將 Hela 細(xì)胞接種于 24 孔板中，1E+5 個(gè)細(xì)胞/孔；轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，按 LipoHigh (µl)：DNA (µg)= 3：1 進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染 4 小時(shí)后更換培養(yǎng)基為含有血清的新鮮培養(yǎng)基， 24 小時(shí)后，奧林巴斯 IX73 熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

原理：帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

應(yīng)用范圍：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞

特點(diǎn)：除了具有陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。（生工產(chǎn)品是E607401 PolyHigh 非脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑）。結(jié)果如下圖所示：

pEGFP-N1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天將 HepG2 細(xì)胞接種于 24 孔板中，1E+5 個(gè)細(xì)胞/孔；轉(zhuǎn)染更換新鮮培養(yǎng)基，按 PloyHigh (µL)：DNA (µg)= 2：1 進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染 4 小時(shí)后更換培養(yǎng)基，24 小時(shí)后，奧林巴斯 IX73 熒光倒置顯微鏡下觀察。

原理：通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中。

主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞

特點(diǎn)：可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大（<8kb），要求細(xì)胞要處于分裂期，需考慮安全因素。如下圖所示：

逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)：逆轉(zhuǎn)錄病毒將自身基因組及其攜帶的外源基因隨機(jī)、穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞基因組中，可實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定、長期的表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)不同的包裝細(xì)胞系可分為單嗜性、雙嗜性和泛嗜性，不同包裝細(xì)胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠特異性地感染某一個(gè)或某一類宿主細(xì)胞。該病毒包裝細(xì)胞系為plat E細(xì)胞系，該細(xì)胞系包含gag、pol和env基因，因此轉(zhuǎn)染單一表達(dá)質(zhì)粒就可以包裝出逆轉(zhuǎn)錄病毒，但是該病毒具有很強(qiáng)的針對性。（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

原理：先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而在αv整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞

主要應(yīng)用：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞

特點(diǎn)：可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需考慮安全因素。如下圖所示：

腺病毒表達(dá)系統(tǒng)：一種很常用的哺乳動(dòng)物病毒表達(dá)系統(tǒng)；但與慢病毒不同的是，腺病毒基因組及其攜帶的外源基因不會(huì)整合入宿主細(xì)胞的基因組中，而是游離于宿主基因組外獨(dú)立表達(dá)，因此可實(shí)現(xiàn)目的基因瞬時(shí)、高豐度的表達(dá)，同時(shí)還避免了因整合而引發(fā)的潛在的基因突變和隨機(jī)效應(yīng)，安全性和可控性高。（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

原理：將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá)。

主要應(yīng)用：瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

特點(diǎn)：可用于人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞。對應(yīng)的結(jié)果如下圖所示：

HEK 293細(xì)胞術(shù)后即刻激光共聚焦掃描顯微照片

用Cy3標(biāo)記的siRNA包裹的直徑為1.0μm的金粒子在100psi的氦氣壓力下進(jìn)行轟擊。Cy3標(biāo)記siRNA上樣：2μg/mg金粒子，a）透射光圖像，b）共焦熒光圖像，c）合并圖像。白色箭頭顯示金顆粒。紅色區(qū)域代表Cy3標(biāo)記siRNA的分布。（圖片來源于Masaki Uchida，Transfection by particle bombardment: Delivery of plasmid DNA into mammalian cells using gene gun .Biochimica et Biophysica Acta 1790 (2009) 754–764）。

原理：用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核。

主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

特點(diǎn)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞。下面是報(bào)道的一篇注射法轉(zhuǎn)染的結(jié)構(gòu)圖：

eGFP和mCherry質(zhì)粒注射

（a） 以1:1的比例注射eGFP和mCherry質(zhì)粒混合物的HFF細(xì)胞。（b） 用eGFP和mCherry質(zhì)粒的混合物以9:1的比例注射HFF細(xì)胞。（來源于文獻(xiàn)：Chow YT，Single Cell Transfection through Precise Microinjection with Quantitatively Controlled Injection Volumes.Sci Rep. 2016 Apr 12;6:24127. doi: 10.1038/srep24127.）

原理：將細(xì)胞短暫暴露于電場中，高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位暫時(shí)穿孔，DNA通過膜上形成的小孔可以吸收外來的遺傳物質(zhì)，此方法也適用于傳遞蛋白質(zhì)。

主要應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞

特點(diǎn)：適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組（>65kb）但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件，拷貝數(shù)較少（1-20）。（詳細(xì)的信息可以參考文獻(xiàn)Potter, H., & Heller, R. (2018). Transfection by  electroporation.Current Protocols in Molecular Biology, 121, 9.3.1–9.3.13. doi:10.1002/cpmb.48）。

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞（24 孔板為例）： 

a) 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前18~24小時(shí)，用500 µl 不含抗生素的培養(yǎng)基接種0.5~2E+5 個(gè)細(xì)胞于24孔板中，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)到70~90%為理想狀態(tài)（具體密度視細(xì)胞的不同可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整）。 

b) 懸浮細(xì)胞：在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前，用500 µl不含抗生素的培養(yǎng)基接種4~8E+5個(gè)細(xì)胞即可。 

2. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染工作液： 

a) 將 0.8~1 µg質(zhì)粒DNA溶于50 µl細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5 min； 

b) 將 2~3 µl 的轉(zhuǎn)染試劑溶于50 µl細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置 5 min； 

c) 將上步含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基加入含有質(zhì)粒DNA的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置 20 min； 

3. 將上述轉(zhuǎn)染混合液，逐滴滴入接種好的細(xì)胞中，輕輕混勻后置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)； 

4. 4~8 小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)； 

5. 轉(zhuǎn)染24~48小時(shí)后，觀察或收取細(xì)胞。如果篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，則在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后將細(xì)胞按1:10或更高的比例接種到新鮮培養(yǎng)基中，第二天加入選擇培養(yǎng)基篩選。