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PEG 介導(dǎo)的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合

發(fā)布時間： 2023-01-12　　點擊次數(shù)： 2765次

簡介
細胞融合的方法有生物法、化學(xué)法和物理法。化學(xué)法常用的是化學(xué)誘導(dǎo)劑聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）結(jié)合高 pH、高鈣離子法。該法操作方便，目前已成為人工誘導(dǎo)細胞融合的主要手段。
原理
PEG 介導(dǎo)的細胞融合的基本原理是利用 PEG 使細胞相互接觸部位的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，加之膜脂雙層的相互親和以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰質(zhì)膜在修復(fù)時相互合并在一起，導(dǎo)致細胞之間發(fā)生融合。PEG 介導(dǎo)的細胞融合率受下述因素影響。

① PEG 的分子量與濃度：分子量及其濃度與融合率成正比；但分子量越大、濃度越高，對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，常用的 PEG 相對分子質(zhì)量為 1000～4000，濃度為 40％～60％。

② PEG 的 pH 值：pH 值在 8.0～8.2 之間融合效-率-最-高。

③ 融合時的溫度：由于生物膜的流動性與溫度成正比，在細胞可承受的溫度范圍內(nèi)適當提高溫度，可提高融合率。

④ 處理時間：處理時間越長，融合率越高，但對細胞的毒害也越大。故一般將處理時間限制在 1.0～1.5 min 之內(nèi)。若融合后不繼續(xù)培養(yǎng)，可將處理時間延長至 20 min。
用途
細胞融合不僅可用于核質(zhì)關(guān)系、基因定位、體細胞的遺傳和發(fā)育等生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，而且在生產(chǎn)實踐上還有重要的應(yīng)用價值，目前已成功應(yīng)用于單克隆抗體的制備、新品種的培養(yǎng)、性狀的改良、疾病的治療和潛伏病毒的研究等領(lǐng)域。
材料與儀器
器材：

① 普通低速離心機

② 恒溫水浴鍋

③ 普通光學(xué)顯微鏡

④ 血細胞計數(shù)板

⑤ 天平、剪刀、鑷子、50 ml 無菌離心管、96 孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管、蓋玻片、載玻片

試劑：

① 材料：鼠、培養(yǎng)的骨髓瘤細胞

② PBS

③ HAT 選擇培養(yǎng)液

④ HT 培養(yǎng)液

⑤ PEG（M，＝4000）（50％）
步驟
PEG 介導(dǎo)的脾細胞與骨髓瘤細胞融合的基本過程可分為如下幾步：

（一）試劑配制

（1）HAT 選擇培養(yǎng)液常用兩種儲存液（100xHT 和 100xA）來稀釋配制 HAT 培養(yǎng)液。

① 100xHT 稱取次黃-嘌-呤 136.1 mg 和胸腺嘧啶核苷 38.8 mg，加細胞培養(yǎng)用水至 100 ml。若溶解不佳，加熱（70 ℃）助溶。100 倍儲存液中，次黃-嘌-呤濃度為 10 mmol/L，胸苷為 1.6 mmol/L。0.22 μm 濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

② 100xA 稱取氨基蝶呤 1.76 mg，溶解于細胞培養(yǎng)用水中。加 1.0 mol/L NaOH 0.5 ml 助溶，再用 1 mol/L HC1 將 pH 調(diào)回至中性，定容至 100 ml。注意勿調(diào)成酸性，因為氨基蝶呤對酸敏感。100 倍儲存液中氨基蝶呤的濃度為 0.04 mmol/L。0.22 μm 濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

③ 將 100xHT 和 100xA 各按 1:100 比例加到含小牛血清的完-全培養(yǎng)基中，即成 HAT 選擇培養(yǎng)液。其中各成分的最終濃度分別為：H,1x10-4 mol/L;A,4x10-7 mol/L;T,1.6x10-5 mol/L。

（2）100xHT 培養(yǎng)液 10 mmol/L 次黃-嘌-呤鈉鹽；1.6 mmol/L 胸腺嘧啶脫氧核苷。

（二）準備脾細胞

（1）處死動物并用乙醇擦拭腹部，剖開腹部暴露脾臟。

（2）用滅菌的鑷子和剪刀取出脾臟，置于一盛有 50 ml 滅菌 PBS 的燒杯中，洗去血污。

（3）把脾臟移入一盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養(yǎng)皿中。除去所有的多余組織和脂肪，并用 PBS 沖洗脾臟。

（4）把脾臟移入盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養(yǎng)皿，用滅菌的剪刀、鑷子剪碎組織，制成單細胞懸液。

（5）收集細胞于 50 ml 離心管，用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗培養(yǎng)皿并轉(zhuǎn)移入離心管。靜置 1 min。

（6）小心把細胞懸液移入一新的離心管，不要讓管底的組織塊一并轉(zhuǎn)入。

（7）用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗有組織塊的離心管，靜置 1 min 后小心移出細胞懸液，并和上一次的細胞懸液混合。

（8）室溫下以 800 g 離心 5 min。

（9）小心棄上清液。用 50 ml 滅菌的 PBS 重懸細胞，重復(fù)離心。

（10）小心棄上清液。在 10 ml 滅菌的 PBS 中重懸細胞。

（11）取 1 滴進行細胞計數(shù)。

（三）準備骨髓瘤細胞

（1）從 2～4 個培養(yǎng)瓶中收集處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞。

（2）用滅菌的 PBS 清洗細胞，800 g 離心 5 min。

（3）重復(fù)洗滌、離心一次。

（4）用 10 ml 滅菌的 PBS 重懸細胞。

（5）取 1 滴進行細胞計數(shù)。

（四）融合步驟

（1）以 3:1～5:1（脾細胞：骨髓瘤細胞）的比例在 50 ml 離心管中混合脾細胞和骨髓瘤細胞（細胞總數(shù)約為 106）。室溫下 800 g 離心 5 min。

（2）盡可能地棄去上清液。輕叩管底使沉淀松動，置 37 ℃（39 ℃ 更佳）水浴中預(yù)溫。

（3）緩慢逐滴加入 1 ml 37 ℃ 預(yù)溫的 50％ PEG 溶液，邊加邊輕搖混勻，加完后用吸管輕輕吹打混勻。37 ℃ 靜置 1 min。

（4）用 20 ml 滅菌的 PBS 稀釋 PEG。注意動作一定要緩慢，尤其是開始稀釋時（最初 1 ml 在 1 min 內(nèi)加完，之后可加快速度）。800 g 離心 5 min，棄上清液。

（5）重復(fù)洗滌、離心一次。

（6）棄上清。在 HAT 培養(yǎng)液中重懸沉淀，使細胞密度為 5x105 個/ml

（7）轉(zhuǎn)入 96 孔培養(yǎng)板，每孔 0.2 ml。在 CO2 培養(yǎng)箱中 37 ℃ 培養(yǎng)
5～7 d，其間根據(jù)需要換 HAT 培養(yǎng)液。

（8）觀察細胞融合結(jié)果。

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PEG 介導(dǎo)的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合

（一）試劑配制

（二）準備脾細胞

（三）準備骨髓瘤細胞

（四）融合步驟